PRZEDRUK, oryginał dostępny pod adresem www
Fragment skryptu: Biologia molekularna roślin
Uniwersytet Warszawski (www)
Instytut Biochemii i Biofizyki PAN (www)
Zakład Biologii Molekularnej Roślin (www)
Kierownik Zakładu: Prof. dr hab. Andrzej Jerzmanowski
Adres:
ul. Pawińskiego 5a,
02-106 Warszawa
Kontakt: tel. (+48 22) 592 5704,
E-mail: andyj@ibb.waw.pl
Zakład Biologii Molekularnej Roślin
Problematyka badawcza: Rola struktury chromatyny w regulacji rozwoju roślin oraz w odpowiedzi na czynniki stresowe i hormonalne. Prowadzone aktualnie badania mają na celu poznanie funkcji roślinnych kompleksów remodelujących chromatynę, histonu H1 i modyfikacji potranslacyjnych histonów rdzeniowych, a także opisanie proteomu jądrowego rośliny modelowej Arabidopsis thaliana.
Stosowane techniki: Większość metod biologii molekularnej, metody biochemii białek, analiza proteomiczna (mass-spec) i transkryptomiczna (mikromacierze), genetyka Arabidopsis thaliana (konstrukcja i analiza mutantów), metody bioinformatyczne.
_______________________________________________________________________________
Ćwiczenie pozwala na sprawdzenie oddziaływania w systemie dwuhybrydowym pomiędzy dwoma jądrowymi białkami roślinnymi: AtSWI3B i FCA
Przed ćwiczeniem zapoznaj się czym jest drożdżowy systemu dwuhybrydowy
Charakterystyka analizownych białek AtSWI3B
U Arabidopsis thaliana istnieje mała rodzina genów posiadająca sekwencje homologiczne do drożdżowego genu SWI3, kodującego ważną podjednostkę dużego kompleksu przebudowującego (remodelującego) chromatynę ySWI/SNF. W roślinach występują cztery białka typu ySWI3: AtSWI3A, AtSWI3B, AtSWI3C oraz AtSWI3D. Białka te zawierają charakterystyczne motywy wysoko konserwowane we wszystkich czterech białkach, a także w drożdżowym SWI3. Białko AtSWI3B jest eksprymowane we wszystkich organach Arabidopsis thaliana, jest białkiem jądrowym oraz komplementuje mutację swego homologa w drożdżach.
FCA
FCA (Flowering Time Control Protein from A. thaliana) jest silnym aktywatorem wejścia rośliny w fazę kwitnienia. Zawiera dwie domeny wiążące RNA i domenę WW odpowiedzialną za wiązanie białko-białko. Transkrypt FCA podlega alternatywnemu składaniu (ang. splicing), w związku z czym w komórce mogą występować cztery warianty transkrypcyjne tego genu.
Test dwuhybrydowy
Jeśli badane białka, czyli AtSWI3B oraz FCA, oddziałują ze sobą, kolonie drożdży staną się niebieskie. Brak niebieskiego zabarwienia będzie świadczył o braku oddziaływań pomiędzy tymi białkami w zastosowanym układzie. Przy przeprowadzaniu testu istotne jest wykonanie szeregu kontroli. Należy wykonać analogiczny test dla drożdży transformowanych pojedynczymi plazmidami (kontrola negatywna), po to, żeby sprawdzić, czy pojedyncze białka nie są zdolne do aktywacji transkrypcji. Dodatkową, wspólną kontrolą dla wszystkich analizowanych układów są drożdże stransformowane plazmidem pLC1 (kontrola pozytywna), dla których również wykonuje się podobny test. Na plazmidzie tym kodowane są obie domeny niezbędne do aktywacji transkrypcji, a zatem domena wiążącą się z DNA (BD) oraz domena aktywująca transkrypcję (AD).
Zabarwienie się kolonii kontroli pozytywnych na kolor niebieski będzie świadczyć o poprawnym wykonaniu testu. Kolonie kontroli negatywnych powinny pozostać białe.
Schemat doświadczenia
1. Izolacja DNA plazmidowego z komórek E. coli
2. Transformacja drożdży konstruktami:
– FCA/pGAD424
– FCA/pGBT9
– AtSWI3B/pGAD424
– AtSWI3B/pGBT9
– FCA/pGAD424 i AtSWI3B/pGBT9
– FCA/pGBT9 i AtSWI3B/pGAD424
– pLC1 (kontrola pozytywna)
2. Hodowla drożdży
3. Test dwuhybrydowy
Tydzień 1
Dzień 1. Izolacja DNA plazmidowego z bakterii
Opracowano szereg metod oczyszczania plazmidowego DNA, z których każda obejmuje trzy etapy:
– hodowlę bakterii
– lizę bakterii,
– oczyszczanie plazmidowego DNA.
Plazmidy izoluje się najczęściej z hodowli płynnych, w których podłoże uzupełnione jest odpowiednim antybiotykiem. Wysokokopijne wektory plazmidowe (np. serii pUC), otrzymywane są z hodowli znajdującej się w późnej fazie logarytmicznej wzrostu, podczas gdy wektory nisko i średniokopijne (np. pBR322) powinny być przed izolacją amplifikowane. Do częściowo wyrośniętej hodowli dodaje się w tym celu chloramfenikol, który selektywnie zapobiega replikacji chromosomu bakteryjnego.
We wszystkich metodach izolacji plazmidowego DNA wykorzystuje się dwie istotne różnice pomiędzy DNA genomowym a DNA plazmidowym bakterii:
– DNA genomowy jest wielokrotnie większy od DNA plazmidu,
– podczas procedury izolacji DNA plazmidowego DNA genomowy zostaje trwale zniszczony, podczas gdy DNA plazmidowy pozostaje w postaci form CCC (ang. covalently closed circle).
Odwirowane komórki bakteryjne poddawane są lizie. Bakterie ulegają lizie pod wpływem niejonowych lub jonowych detergentów (SDS, Sarkozyl, Triton X-100), rozpuszczalników organicznych, roztworów alkalicznych (liza alkaliczna) lub wysokiej temperatury (liza termiczna). Stosowany może być również lizozym – enzym trawiący ścianę komórkową bakterii (nie działa w pH<8.0).
W metodzie lizy alkalicznej bufor o wysokim pH zawierający NaOH i SDS powoduje całkowitą lizę komórki, jak również denaturację genomowego DNA, natomiast plazmidowy DNA w formie CCC zostaje zdenaturowany jedynie na niewielkich odcinkach.
W przypadku otrzymywania plazmidowego DNA metodą termiczną, czynnikiem denaturującym jest wysoka temperatura, w której DNA genomowy i plazmidowy zachowują się podobnie jak w wysokim pH.
Następny etap oczyszczania DNA polega na oddzieleniu DNA od związanych z nim białek. Zwykle stosu-je się do tego celu nasycony buforem roztwór fenolu lub jego mieszaninę z chloroformem i alkoholem izoamylowym. Białka można również usunąć przez trawienie ich proteinazami (zwykle proteinazą K). Usunięcie RNA przeprowadza się enzymatycznie, inkubując próbki z RNazą (wolną od DNaz), przez sączenie molekularne lub wirowanie w gradiencie gęstości (patrz, dalej). W metodzie lizy alkalicznej, kiedy liniowe cząsteczki DNA ulegają denaturacji natomiast superzwinięte formy CCC plazmidu są po denaturacji nadal splecione, neutralizacja pH roztworami o wysokim stężeniu soli (np. octan amonu) prowadzi do denaturacji jedynie DNA plazmidowego, podczas gdy DNA genomowy wraz z RNA i białkami wytrąca się w postaci serowatego osadu. Z odbiałczonych próbek, DNA wytrącany jest alkoholem etylowym lub izopropanolem w obecności octanu potasowego, sodowego lub amonowego.
Izolacja DNA plazmidowego na małą skalę (minilizaty)
Odczynniki i aparatura:
– hodowle płynne bakterii
– RNaza (10 mg/ml)
– roztwór I: 25 mM Tris-HCl pH 8,0; 50 mM glukoza, 10 mM EDTA
– roztwór II: 0.2 M NaOH, 1 % SDS (przygotować tuż przed użyciem)
– roztwór III: 7.5 M octan amonu
– etanol 96 %
– etanol 70 %
– woda miliQ
– agaroza,
– bromek etydyny (10 mg/ml),
– bufor TBE (45 mM Tris-boran, 1 mM EDTA),
– barwnik do elektroforezy,
– probówki Eppendorfa,
– mikrowirówka,
– SpeedVac,
– aparat do elektroforezy.
Wykonanie (około 2 godz.)
Plazmidy będą izolowane z 5 hodowli bakteryjnych: AtSWI3B/pGBT9, AtSWI3B/pGAD424, FCA/pGBT9, FCA/pGAD424, pLC1.
– rozlać hodowle bakteryjne do odpowiednio podpisanych probówek Eppendorfa (po 1,5 ml) i zwirować bakterie w mikrowirówce przez 1 minutę (2 x 1.5 ml)
– odsączyć pipetą pożywkę do sucha,
– zawiesić osad końcówką do pipety w 100 μl roztworu I, dodać 5 μl RNazy
– inkubować przez 5 minut w temperaturze pokojowej
– do probówki Eppendorfa dodać 200 μl świeżo przygotowanego roztworu II
– zamieszać BARDZO DELIKATNIE i wstawić do lodu na 5 minut
– dodać 150 μl zimnego (z lodówki) roztworu III, dwukrotnie BARDZO SILNIE wstrząsnąć i wstawić do lodu na 10 minut
– zwirować 15 minut
– zebrać klarowny supernatant (jeśli supernatant nie jest klarowny, można zwirować go powtórnie)
– dodać 450 ul izopropanolu i inkubować na lodzie 2 min
– zwirować 20 minut w mikrowirówce
– zlać izopropanol, osad przemyć (nie zawieszać) 1 ml etanolu 70%, zwirować
– wysuszyć w SpeedVacu (do 5 minut)
– osad zawiesić w 20 μl wody MiliQ
– przygotować 0,8% żel agarozowy w buforze TBE (dodać bromku etydyny do stężenia 0,5 μg ml)
– nanieść na żel 5 μl preparatu z 1 μl barwnika do elektroforezy
– prowadzić elektroforezę w buforze TBE przy napięciu nie przekraczającym 100V
– sfotografować żel na transiluminatorze w świetle UV (ocenić jakość i ilość DNA w preparacie)
Dzień 2. Transformacja drożdży
Jest to szybka, jednoetapowa metoda uzyskania kompetentnych komórek drożdży i ich transformacji. Uważa się, że obecność ditiotreitolu (DTT) w roztworze A używanym do transformacji drożdży zmienia strukturę kompleksów manno proteidowych w ich ścianie komórkowej. W efekcie zwiększa się liczba porów lub/oraz plastyczność ścian komórkowych, co sprzyja przedostawaniu się wysokocząsteczkowych kwasów nukleinowych do wnętrza komórek. Jednoniciowy nośnikowy DNA dodatkowo ułatwia wprowadzanie cząsteczek plazmidu do komórek drożdży.
Drożdże po transformacji wysiewa się na pożywkę minimalną (WO) z dodatkiem jedynie tych aminokwasów, których dane transformanty nie są w stanie same syntetyzować. Na plazmidzie pGBT9 znajduje się jeden z genów szlaku biosyntezy tryptofanu, natomiast na plazmidzie pGAD424 oraz pLC1 – leucyny. Dlatego też drożdże po transformacji plazmidem pGBT9 wysiewa się na pożywkę minimalną WO bez tryptofanu, drożdże po transformacji plazmidem pGAD424 lub pLC1 na pożywkę WO bez leucyny, a drożdże po transformacji oboma plazmidami (podwójne tansformanty) pGAD424 oraz pGBT9 na WO bez leucyny i tryptofanu. Postępowanie takie umożliwia wyselekcjonowanie transformantów (użyty szczep drożdży nie jest w stanie syntetyzować tryptofanu ani leucyny). Wydajność tej metody wynosi około 104 transformantów/μg plazmidowego DNA.
Materiały:
– Roztwór A: 60% glikol polietylenowy 3350 (PEG 3350), 0,2 M octan litu, 100 mM ditiotreitol (DTT)
– Jednoniciowy DNA nośnikowy (10 mg/ml) – YPD – pożywka pełna do hodowli drożdży (bacto-pepton 1%, ekstrakt drożdżowy 1%, agar 2%)
– WO – pożywka używana do selekcji transformantów (yeast nitrogen base) 0,67%, glukoza 2%, agar 2%, mieszanina aminokwasów i nukleotydów z wyjątkiem wymagania pokarmowego używanego do selekcji, np. tryptofanu: WO–trp, leucyny: WO‑leu)
– Szczep drożdży Y190
– Preparaty plazmidowego DNA: AtSWI3B/ pGBT9, AtSWI3B/pGAD424, FCA/pGBT9 FCA/pGAD424, pLC1
– Probówki typu Eppendorf
– Głaszczka
– Sterylne wykałaczki
– Palnik, zapalarka
– Lód
Wykonanie (około 45 minut)
1. Przygotować bufor A, składający się z 600 μl PEG, 200 μl octan litu, 100 μl
1M DTT oraz 40 μl H2O (bufor A należy przygotować tuż przed transformacją). DTT jest substancją szkodliwą, należy pracować w rękawiczkach!
2. Do 7 probówek Eppendorfa (1,5 ml) dodać po 100 μl buforu A .
3. Do każdej probówki dodać po 5 μl nośnikowego DNA (ang. carrier DNA). Nośnikowy DNA należy trzymać w lodzie.
4. Do probówki:
– nr 1 dodać 5 μl (ok. 300 ng) plazmidowego DNA AtSWI3B/pGBT9 (kontrola negatywna testu dwuhybrydowego)
– nr 2 dodać 5 μl plazmidowego DNA FCA/pGBT9 (kontrola negatywna testu dwuhybrydowego)
– nr 3 dodać 5 μl plazmidowego DNA (AtSWI3B/pGAD424) (kontrola negatywna testu dwuhybrydowego)
– nr 4 dodać 5 μl plazmidu FCA/ pGAD424 (kontrola negatywna testu dwuhybrydowego)
– nr 5 dodać po 5 μl dwóch preparatów plazmidowego DNA (AtSWI3B/pGBT9 oraz FCA/pGAD424)
– nr 6 dodać po 5 μl dwóch preparatów plazmidowego DNA (AtSWI3B/pGAD424 oraz FCA/pGBT9)
– nr 7 dodać 5 μl plazmidu pLC1 (kontrola pozytywna testu dwuhybrydowego).
5. Zebrać sterylną wykałaczką po około 1 mm3 drożdży (szczep Y190) z powierzchni pożywki stałej (drożdże hodowane w temperaturze 30OC przez 2-3 dni na pożywce YPD) i dodać do probówek, zworteksować.
6. Wszystkie otrzymane mieszaniny inkubować w bloku grzejnym lub łaźni wodnej w temperaturze 45ºC przez 30 min.
7. Całość przenieść na szalki:
– mieszaninę zawierającą plazmid AtSWI3B/ pGBT9 na szalkę WO-trp
– mieszaninę zawierającą plazmid FCA/ pGAD424 na szalkę WO-leu
– mieszaninę zawierającą plazmid AtSWI3B/ pGAD424 na szalkę WO-leu
– mieszaninę zawierającą plazmid FCA/pGBT9 na szalkę WO-trp
– mieszaninę zawierającą oba plazmidy na szalki WO-trp-leu
– mieszaninę zawierającą plazmid pLC1 na szalkę WO-leu
8. Mieszaniny transformacyjne delikatnie rozprowadzić głaszczką po całej powierzchni szalek. Szalki zaparafilmować. 9. Drożdże na szalkach hodować przez 2-3 dni w cieplarce w temperaturze 30ºC (do momentu pojawienia się białych kolonii).
UWAGA! Do testu dwuhybrydowego używa się 2-3 dniowych kolonii, w innym wypadku sygnał jest bardzo słaby, lub w ogóle niewidoczny.
Tydzień ½
Przygotowanie do wykonania testu dwuhybrydowego
Materiały:
– Szalki WO-trp-leu, WO-trp, WO-leu
– Sterylne wykałaczki
– Palnik
– Zapalarka lub zapałki
Wykonanie: (około 15 minut)
1. Pobrać sterylną wykałaczką po kolei pojedyncze białe kolonie z szalek (po kilka kolonii z każdej szalki)
– WO-trp-leu (podwójne transformanty),
– WO-leu (drożdże transformowane plamidem pLC1 lub plazmidem pGAD424),
– WO-trp (drożdże transformowane plazmidem pGBT9) i przenieść je na 3 nowe szalki WO-trp-leu, WO-leu,
-WO-trp, rozprowadzić je po niewielkiej powierzchni szalki (ok. cm2 na jedną kolonię).
2. Szalki inkubować przez 2-3 dni w 30oC.
Tydzień 2
Dzień 1. Test dwuhybrydowy
Zamrożenie komórek drożdży w ciekłym azocie, a następnie ich rozmrożenie powoduje uszkodzenie i uwolnienie białek na zewnątrz komórek. Jeśli dwaj potencjalni partnerzy białkowi oddziałują ze sobą, to przyłączone do nich domeny, tj. domena wiążąca się z DNA (BD) oraz domena aktywująca transkrypcję (AD), zbliżają się do siebie i wówczas następuje ekspresja genu β-galaktozydazy. Po dodaniu do roztworu substratu dla β-galaktozydazy, którym jest X-gal, dochodzi do hydrolizy wiązania β-D-galaktozydowego.
Jednym z produktów tej reakcji jest niebieski 5-bromo-4-chloro-3-indol. Produkt taki, a zatem także i niebieskie zabarwienie, świadczy o tym, że oba badane białka oddziałują ze sobą. Brak zabarwienie będzie dowodem tego, że oddziaływania takie nie zachodzą. Jak zostało to już wcześniej wspomniane, należy wykonać kontrole zarówno pozytywne, jak i negatywne. Kontrolą negatywną są drożdże transformowane pojedynczymi plazmidami, zaś pozytywną drożdże stransformowane plazmidem pLC1.
Materiały:
– Bufor Z: 60 mM Na2PO4; 10 mM KCl; 1 mM MgSO4; pH 7,0
– Bufor Z/X-gal: do 10 ml buforu Z dodać 27 μl Β-merkaptoetanolu i 167 μl X-gal z roztworu wyjściowego o stężeniu 20 mg/ml (2-merkaptoetanol i X-gal dodać tuż przed użyciem! 2-merkaptoetanol oraz X-gal są substancjami szkodliwymi, należy pracować w rękawiczkach! 2-merkaptoetanol należy dodawać pod wyciągiem!)
– Krążki bibuły Whatmann dopasowane wielkością do średnicy szalki
– Puste szalki
– 20 mg/ml X-gal (5-bromo-4-chloro-3- indolilo-β-D-galaktopiranozyd) rozpuszczony w dimetyloformamidzie
– Ciekły azot
Wykonanie: (ok. 30 minut)
1. Przygotować roztwór 10 ml Z/X-Gal
2. Przygotować 3 puste szalki (na kolonie z szalek WO-trp, WO-trp-leu, WO-leu)
3. Wyciąć 6 krążków bibuły (dopasowane do średnicy szalek) i wyłożyć po jednym krążku na każdą szalkę
4. Krążki na szalkach nasączyć buforem Z/X-gal rozprowadzając po 2 ml na krążek uważając żeby nie powstały bąble powietrza między szalką a bibułą i zlać nadmiar buforu z szalki
5. Na każdą szalkę z drożdżami
– WO-trp-leu,
– WO-trp (kontrola negatywna)
– WO-leu (kontrole negatywne i pozytywna)
– przyłożyć po krążku bibuły Whatman i odcisnąć na nim kolonie.
6. Zdjąć po kolei pęsetą krążki z szalek i zamrozić w ciekłym azocie przez 5 sekund, po czym przełożyć je koloniami do góry na przygotowane wcześniej szalki, uważając by nie powstały bąble powietrza między dwoma krążkami.
7. Szalki inkubować w 37ºC przez 12 – 24 godziny.
Dzień 2 Interpretacja wyników
1. Wyjąć szalki z cieplarki
2. Zanalizować zabarwienie/brak zabarwienia na szalkach
3.Zinterpretować otrzymane wyniki
