Autor: Dominika Mielniczuk
CRISPR (ang. clustered regularly interspaced short palindromic repeats) oznacza zgrupowane, regularnie rozmieszczone, krótkie, powtarzające się sekwencje palindromowe. Locus CRISPR zlokalizowano po raz pierwszy w 1987 roku w genomie bakterii E. coli. Odkryto, że sekwencja ta składa się z 14 powtórzeń (ang. direct repeats – DRS), w których skład wchodzi 29 nukleotydów oddzielonych sekwencjami łącznikowymi (ang. spacers) (Jaworski i Dobrowolska, 2009). Późniejsze badania wykazały obecność sekwencji CRISPR u 40% prokariontów oraz 90% archeonów, gdzie występują w chromosomie lub plazmidach (Jaworski i Dobrowolska, 2009 ; Burstein i in., 2017). Naukowcy przez wiele lat starali się określić rolę loci CRISPR. Początkowo uważano, że mechanizm ten odpowiada za naprawę DNA oraz regulację ekspresji genów. Badania przeprowadzone w 2002 roku pozwoliły naukowcom zidentyfikować białka Cas (ang. CRISPR associated proteins) związane z mechanizmem CRISPR, które wykazują aktywność helikaz oraz nukleaz. Udowodniono, że ochrona przed infekcjami fagowymi należy do jednego z głównych zadań systemu CRISPR-Cas. Mechanizm działania polega na wprowadzeniu do materiału genetycznego bakterii krótkich odcinków fagowego DNA (Jaworski i Dobrowolska, 2009). Dzięki temu podczas kolejnej infekcji możliwe staje się rozpoznanie obcego DNA przez bakterie oraz zneutralizowanie bakteriofaga.
Elementy wchodzące w skład struktury matrycy – locus CRISPR warunkujące właściwości immunogenne tego systemu to:
• sekwencje powtórzone (R, ang. direct repeats) – ciąg identycznych sekwencji, które są ściśle konserwowane w danym locus, posiadają wielkość od 26 do 72 pz;
• sekwencje rozdzielające (S, ang. spacers) – sekwencje o wielkości 21-72 pz, występujące pomiędzy sekwencjami powtórzonymi;
• sekwencja liderowa – niekodująca sekwencja, zawierająca promotor sprawiający, że transkrypcja regionu CRISPR staje się możliwa;
• geny cas – zespół genów kodujących białka, zawierające funkcjonalne domeny, które są typowe dla nukleaz, helikaz, polimeraz oraz innych białek wiążących kwasy nukleinowe (Baj i in., 2016 ; Nakonieczna i in., 2018).
Wyróżnia się trzy główne typy systemu CRISPR-Cas (Makarova i in., 2011). W systemie CRISPR/Cas typu I obróbka prekursorowego RNA możliwa jest dzięki działaniu endonukleaz z rodziny Cas6. Sekwencja docelowa zostaje rozpoznana przez wielopodjednostkowy kompleks – Cascade (CasABCDE), natomiast białko Cas3 odpowiedzialne jest za jej przecięcie (Sinkunas i in., 2011). Motyw PAM znajduje się na końcu 5’ nici DNA sekwencji protospacer identycznej z crRNA (Czarnek i Bereta, 2016). Wyznacznikiem przynależności do II typu systemu CRISPR/Cas jest obecność genu Cas9 (Czarnek i Bereta, 2016). Cas9 jest to duże białko, w skład którego wchodzą min. dwie domeny nukleazowe: HNH i RuvC. Każda domena odpowiada za trawienie jednej nici DNA (Jinek i in., 2012).
Działanie bakteryjnego systemu CRISPR/Cas9 składa się z następujących etapów:
• adaptacja – pozyskiwanie fragmentu materiału genetycznego faga, który zainfekował komórkę bakteryjną po raz pierwszy;
• wprowadzenie pozyskanego fragmentu do matrycy CRISPR za pierwszą sekwencją powtórzoną;
• duplikacja powtórzenia w celu zachowania prawidłowej struktury matrycy (sekwencja powtórzona – sekwencja rozdzielająca – sekwencja powtórzona);
• ekspresja – etap ten rozpoczyna transkrypcja długiego odcinka pre-crRNA;
– uzyskiwanie dojrzałych crRNA (ang. CRISPR RNA) komplementarnych do sekwencji bakteriofagowego DNA, poprzez cięcie w obrębie pre-crRNA katalizowane przez endonukleazę;
– syntetyzowanie białek Cas9 oraz tracrRNA (ang. trans-activating crRNA);
– tworzenie dupleksu pomiędzy cząsteczką tracrRNA a komplementarną do niej cząsteczką crRNA;
• nukleaza Cas9 przecina obce DNA co uniemożliwia proliferację faga.
Dzięki krótkim sekwencjom nukleotydowym – PAM (ang. Protospacer adjacent motif) – charakterystycznych dla każdego szczepu bakterii możliwe jest odnajdywanie sekwencji komplementarnych do crRNA np.: dla białka Cas9 wyizolowanego ze szczepu Streptococcus pyogenes, sekwencją PAM jest 5’-NGG-3’.
System CRISPR/Cas typu III można podzielić na dwa podtypy: A i B. Cząsteczkami docelowymi dla podtypu IIIA jest DNA oraz RNA, który powstał na jego matrycy (Czarnek i Bereta, 2016). Jednoniciowe RNA jest trawione przez locus CRISPR IIIB. Niepoznana jak dotąd nukleaza tnie crRNA, co prowadzi do powstawania heterogennej populacji dojrzałych crRNA, które różnią się od siebie długością. Obce elementy genetyczne mogą być usuwane tylko wtedy, kiedy obecny jest kompleks w którego skład wchodzi Cas10. W podtypie IIIA kompleks ten nazywa się Csn, natomiast w podtypie IIIB nosi nazwę Cmr (Makarova i in., 2011). W podtypie IIIA proces trawienia DNA i RNA zachodzi niezależnie. Sekwencja PAM dla loci CRISPR typu III nie została jak dotąd zidentyfikowana (Czarnek i Bereta, 2016). Warunkiem podczas cięcia obcego DNA in vivo przez Csm jest brak homologii między końcem 5’ crRNA a obszarem, który sąsiaduje z końcem 5’ targetowanego DNA. Brak homologii uważany jest za mechanizm obronny bakterii przed niszczeniem własnego DNA poprzez system CRISPR/Cas typu III (Samai i in., 2015).
Laboratoryjne systemy CRISPR/Cas stosowane obecnie w inżynierii genetycznej różnią się nieco od bakteryjnego systemu CRISPR typu II (CRISPR/Cas9) wyizolowanego min. z organizmu Streptococcus pyogenes. W odróżnieniu od bakteryjnego systemu CRISPR typu II w systemach stosowanych do precyzyjnej modyfikacji genomowego DNA komórek eukariotycznych, nie występuje etap adaptacji (Nakonieczna i in., 2018). Wprowadzenie zmian w pożądanym miejscu genomu wymaga dostarczenia komórce niezbędnych elementów ,,z zewnątrz’’ (Czarnek i Breta, 2016). Na plazmidzie do wybranej komórki wprowadza się geny kodujące białko Cas9 oraz odcinek sgRNA (ang. single guide RNA) (Nakonieczna i in., 2018). Synteza sgRNA w komórkach eukariotycznych możliwa jest dzięki działaniu endogennej polimerazy RNA III (Czarnek i Bereta, 2016). Cząsteczka sgRNA powstaje na skutek połączenia tracrRNA oraz crRNA, które do komórki wprowadzane są jako pojedynczy konstrukt, dzięki czemu mechanizm CRISPR cechuje większa wydajność (Doudna i in., 2014; Nakonieczna i in., 2018). Kompleks powstały z połączenia zsyntetyzowanego białka Cas9 oraz sgRNA, pełni funkcję nożyczek molekularnych. Kompleks Cas9-sgRNA przeszukuje nić DNA komórki w celu znalezienia sekwencji komplementarnej do crRNA. Kiedy sekwencja zostanie odnaleziona, nukleaza Cas9 precyzyjnie tnie nić DNA (Nakonieczna i in., 2018). Miejsce cięcia zależne jest od obecności sekwencji PAM, która powinna znajdować się bezpośrednio za poszukiwanym fragmentem DNA (Czarnek i Bereta, 2016). Powstają w ten sposób DSB (ang. Double-strand breaks) – cięcia podwójnej nici, które naprawiane są przez naturalnie występujące mechanizmy naprawcze (Nakonieczna i in., 2018). Cięcia znajdujące się na podwójnej nici DNA mogą zostać naprawione przez jeden z dwóch konkurencyjnych mechanizmów naprawczych (Illumina, 2017). Wybór mechanizmu zależy od organizmu wykorzystywanego do badań, oraz od fazy cyklu w którym znajduje się komórka (Nowosad i in., 2016). Pierwszym z nich jest mechanizm rekombinacji homologicznej (HDR, ang. homology-directed repair), drugi mechanizm rekombinacji niehomologicznej (NHEJ, ang. non-homologus end joining) (Nakonieczna i in., 2018). HDR daje możliwość zmiany genu na inną jego wersję. Do jądra komórki eukariotycznej wprowadzony zostaje fragment DNA, który zawiera pożądaną sekwencję. Fragment ten paruje się z DNA komórki w miejscu cięcia podwójnej nici, gdzie zastępuje oryginalną sekwencję, np. ,,zdrową’’ kopią genu. Mechanizm ten wykorzystuje się do wprowadzania ściśle określonych zmian w danym locus. Do zmian tych zaliczamy: mutacje punktowe, insercje, delecje (Czarnek i Bereta, 2016). Wybierając drugi mechanizm (NHEJ) pęknięcie zostaje naprawione, poprzez połączenie końców DSB przez enzym posiadający właściwości ligaz. W wyniku takiego połączenia powstają mutacje typu indel: insercja lub delecja, co powoduje zmianę ramki odczytu , skutkiem czego jest wyłączenie genu (Wright i in., 2016 ; Czarnek i Breta 2016). Zastosowanie mechanizmów HDR i NHEJ powoduje zachodzenie trwałych oraz ukierunkowanych zmian w genomie – wyłączenie genu (knock-out) lub wprowadzenie nowego genu (knock-in) (Nakonieczna i in., 2018). Należy jednak zwrócić uwagę na to, że w przeciwieństwie do mechanizmu NHEJ w trakcie trwania HDR zostaje odbudowany utracony fragment DNA (Nowosad i in., 2016).
Geny CRISPR/Cas9, które są wprowadzane na plazmidzie, mogą kodować cząsteczki sgRNA, które skierowane są przeciwko różnym sekwencjom. Proces ten nosi nazwę multipleksowania. Umożliwia on wprowadzenie zmian w wielu genach co znacznie przyspiesza oraz ułatwia edycję genomu (Horvath i in., 2010 ; Czarnek i Breta., 2016).
W zależności od tego jaki wektor zostanie zastosowany do przeprowadzenia procesu, wyróżnia się kilka metod umożliwiających wprowadzenie DNA do komórki :
• wektory wirusowe – najczęściej wykorzystywane nośniki DNA, są to wektory na bazie parwowirusów i lentiwirusów, nie stanowią zagrożenia dla gospodarza;
• wektory niewirusowe – użycie tych wektorów cechuje się wysokim bezpieczeństwem oraz dużą wydajnością, istnieje tylko kilka wektorów niewirusowych, które zdolne są do transportu CRISPR/Cas9, rosnąca popularność tych nośników w znacznym stopniu przyczyniła się do powstania wielu technik wprowadzania wektorów niewirusowych, min. elektroporacji, iniekcji hydrodynamicznej, nanonośników lipidowych (Nowosad i in., 2016).
Obecnie mechanizm CRISPR/Cas9 cieszy się największym uznaniem spośród wyżej opisanych, co spowodowane jest wysoką specyficznością oraz łatwością projektowania konstruktu (Sega i Linkiewicz, 2014). Dodatkową zaletą jest to, że mechanizm ten bazuje na naturalnym systemie odpornościowym. Ponadto nukleaza Cas9 jest zdolna do cięcia metylowanego DNA (Hsu i in., 2013). Procesy multipleksowania oraz uzyskiwania ekspresji syntetycznych RNA zachodzących w trakcie jednego doświadczenia pozwalają znacznie obniżać nakłady finansowe oraz skracać czas trwania eksperymentu (Cong i in., 2013).
Literatura:
“Illumina”[Online].[przeglądany: 16.11.2018]. Dostęp:https://www.illumina.com/content/dam/illumina-marketing/documents/products/research_reviews/publication-review-gene-editing-research.pdf
BAJ J., MARKIEWICZ Z., 2016. Biologia molekularna bakterii. Warszawa: Wydawnictwo Naukowe PWN. ISBN: 978-83-01-18183-3
BURSTEIN D., HARRINGTON L., STRUTT S., PROBST A., ANANTHARAMAN K., i wsp., 2017. New CRISPR-Cas systems from uncultivated microbes. Nature, 542, 237-253.
CONG L., COX F.A., LIN S., BARRETTO R., HABIB N., HSU P.D., WU X., JIANG W., MARRAFFINI L.A, ZHANG F., 2013. Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas systems. Science, 339, 819-832.
CZARNEK M., BERETA J., 2016. System CRISPR-Cas – od odporności bakterii do inżynierii genomowej. Postępy Higieny i Medycyny Doświadczalnej, 70, 901-916.
DOUDNA J.A, CHARPENTIER E., 2014. The new frontier of genome engineering witch CRISPR/Cas9. Science, 346 (6213), 1077-1085.
HORVATH P., BARRANGOU R., 2010. CRISPR-Cas, the immune system of Bacteria and Archaea. Science, 157, 167-170.
HSU P.D, SCOTT D.A, WEINSTEIN J.A, RAN F.A, KONERMANN S., AGARWALA V., LI Y., FINE E.J., WU X., SHALEM O., CRADICK T.J., MARRAFFINI L.A., BAO G., ZHANG F., 2013. DNA targeting specificity of RNA-guided Cas9 nucleases. Nature Biotechnology, 31 (9), 827-832.
JAWORSKI A., DOBROWOLSKA A., 2009. System interferencyjnego RNA bakterii (CRISPR-Cas) i jego rola w obronie przed infekcją fagową. Postępy Mikrobiologii, 48 (1), 23-29.
JINEK M., CHYLINSKI K., FONFARA I., HAUER M., DOUDNA J.A., CHARPENTIER E., 2012. A Programmable Dual-RNA-Guided DNA Endonuclease in Adaptive Bacterial Immunity. Science, 337 (6096), 816-821.
MAKAROVA K.S., HAFT D.H., BARRANGOU R., BROUNS S.J.J., CHARPENTIER E., HORVATH P., MOINEAU S., MOJICA F.J., WOLF Y.I, YAKUNIN A.F., VAN DES OOST J., KOONIN E.V., 2011. Evolution and classification of the CRISPR-Cas systems. Nature Reviews Microbiology. 9 (6), 467-477.
NAKONIECZNA K., RADULEWICZ A., MALEC P., 2018. Mechanizm CRISPR-Cas9. Nauki Przyrodnicze i Medyczne: Najnowsze doniesienia dotyczące nauk medycznych i biotechnologicznych. Lublin: Instytut Promocji Kultury i Nauki. ISBN 978-83-950719-1-1
NOWOSAD K., STĘPIEŃ P., MUSIAŁ P., 2016. CRISPR-Cas9 nowe narzędzie inżynierii genetycznej. Wydawnictwo naukowe TYGIEL sp. z o.o, 1 (6), 76-87.
SAMAI P., PYENSON N., JIANG W., GOLDBERG G.W. ,HATOUM-ASLAN A., MARRAFFINI L.A., 2015. Co-transcriptional DNA and RNA Cleavage durning Type III CRISPR-Cas Immunity. Cell, 161 (5), 1-11.
SINKUNAS T., GASIUNAS G., FREMAUX C., BARRANGOU R., HORVATH P., SIKSNYS V., 2011. Cas3 is a single-stranded DNA nuclease and ATP-dependent helicase in the CRISPR/Cas immune system. The European Molecular Biology Organization, 30 (7), 1335-1342.
WRIGHT A.V., NUNEZ J.K., DOUDNA J.A, 2016. Biology and Applications of CRISPR Systems: Harnessing Nature’s Toolbox for Genome Engineering. Cell, 164, 29-44.
